分子生物学第八章杂交与芯片技术.pptx
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1、 第八章第八章杂交与芯片技术杂交与芯片技术学习目标学习目标掌握掌握:1核酸分子杂交的基本概念。核酸分子杂交的基本概念。2探针的种类与标记方法。探针的种类与标记方法。3常见核酸分子杂交技术的原理。常见核酸分子杂交技术的原理。4DNA芯片的设计与制备。芯片的设计与制备。熟悉:熟悉:1核酸分子杂交信号的检测方法。核酸分子杂交信号的检测方法。了解:了解:1核酸杂交与核酸杂交与DNA芯片技术的应用芯片技术的应用。第一节第一节杂交的基本概念杂交的基本概念杂交杂交杂交(杂交(hybridization)是指不同来源的单链)是指不同来源的单链核酸核酸,根据根据碱基互补配对原则,在适当的条件下形成杂化碱基互补配
2、对原则,在适当的条件下形成杂化双链的过程双链的过程。利用利用核酸杂交检测目的核酸的方法称为核酸分子杂核酸杂交检测目的核酸的方法称为核酸分子杂交交技术技术.核酸杂交是核酸杂交是定性或定量检测靶定性或定量检测靶DNA或或RNA的方法的方法探针探针探针是指带有标记的单链核酸。探针是指带有标记的单链核酸。探针探针能与靶核酸序列互补,可在适当条件下,通过能与靶核酸序列互补,可在适当条件下,通过碱基互补配对的方式与靶核酸序列杂交碱基互补配对的方式与靶核酸序列杂交,再根据,再根据标标记信号判断靶核酸序列的位置和含量。记信号判断靶核酸序列的位置和含量。一、核酸分子杂交一、核酸分子杂交核酸杂交是基于核酸变性和复
3、性的特性建立的核酸杂交是基于核酸变性和复性的特性建立的。不同不同种类的单链种类的单链DNA分子或分子或RNA分子,分子,只要两条只要两条单链之间单链之间存在一定程度的碱基互补配对,就有可存在一定程度的碱基互补配对,就有可能形成杂化双链(能形成杂化双链(heteroduplex)。核酸分子杂交核酸分子杂交我们我们把不同来源的单链核酸形成双链的过程称为把不同来源的单链核酸形成双链的过程称为核酸分子杂交核酸分子杂交。可以是可以是DNA和和DNA单链单链之间杂交,之间杂交,也可以是也可以是RNA和和RNA单链间的杂交,甚至可以是单链间的杂交,甚至可以是DNA单链和单链和RNA单链之间杂交。单链之间杂交
4、。核酸分子杂交核酸分子杂交二、探针的类型二、探针的类型探针可分为基因组探针可分为基因组DNA探针、探针、cDNA探针、探针、RNA探针、寡核苷酸探针四大类。探针、寡核苷酸探针四大类。1寡核苷酸探针优点优点是:是:制备方便,可根据需要自行设计,避免制备方便,可根据需要自行设计,避免了天然核酸探针存在的高度重复序列;了天然核酸探针存在的高度重复序列;由于寡核由于寡核苷酸探针苷酸探针长度只有长度只有1530bp,其中即使有一个碱基,其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度。因此它特别适用不配对也会显著影响其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变杂交分析于基因点突变杂交分析;寡核苷酸探针比活度高,
5、适用于大多数比活度高,适用于大多数杂交。如杂交。如DNA序列测序列测定、定、Southern杂交、杂交、Northern杂交、原位杂交等杂交、原位杂交等。缺点缺点是探针短是探针短,特异性,特异性差差,杂交,杂交体稳定性差体稳定性差,杂,杂交交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高,操作难及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高,操作难度大,背景噪音也大。度大,背景噪音也大。 2基因组DNA探针基因组基因组DNA经经机械机械剪切或限制性内切酶剪切或限制性内切酶消化制备消化制备成一定大小的成一定大小的DNA片段,再将这些片段插入到适当片段,再将这些片段插入到适当的载体中,转化宿主细胞,构建成基因组的载体中,转化
6、宿主细胞,构建成基因组DNA文库。文库。从从文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆,经扩增、文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆,经扩增、提取提取DNA、酶切及电泳分离,即可得到、酶切及电泳分离,即可得到足量足量的基因的基因片段,经适当的标记后,即为基因组片段,经适当的标记后,即为基因组DNA探针。探针。基因组DNA探针也也可采用可采用PCR方法扩增基因组方法扩增基因组DNA片段,制备基因片段,制备基因组组DNA探针探针。选择选择此类探针时要特别此类探针时要特别注意基因组注意基因组中存在的高度重中存在的高度重复序列,尽可能使用基因的编码序列(外显子)作复序列,尽可能使用基因的编码序列(外显子)作为探
7、针,避免使用内含子及其它非编码为探针,避免使用内含子及其它非编码顺序。顺序。基因组DNA探针因为高度重复序列因为高度重复序列的的存在,可能引起存在,可能引起非特异性杂交非特异性杂交而出现假阳性而出现假阳性。优点优点:制备方法简单,不易降解,标记方法成熟。:制备方法简单,不易降解,标记方法成熟。 3cDNA探针由由mRNA逆转录而来,在逆转录酶的作用下,以逆转录而来,在逆转录酶的作用下,以mRNA 为模板,合成为模板,合成cDNA第一链,进而合成第二第一链,进而合成第二链。将合成的链。将合成的cDNA插入到适当的载体中,构建插入到适当的载体中,构建cDNA文库。文库。然后然后筛选适当的阳性克隆,
8、再进一步扩增、酶切及筛选适当的阳性克隆,再进一步扩增、酶切及纯化该纯化该cDNA片段,标记即可。片段,标记即可。cDNA探针也也可采用可采用PCR方法扩增方法扩增。该方法的优点:双该方法的优点:双链探针,长度较长,可与靶序列链探针,长度较长,可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高,形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高,杂交信号强杂交信号强。缺点缺点是由于是双链,必须先变性再杂交,在杂交过是由于是双链,必须先变性再杂交,在杂交过程中还存在自我复性现象。程中还存在自我复性现象。4RNA探针分离分离的的RNA或者利用噬菌体依赖于或者利用噬菌体依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶以双
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- 分子生物学 第八 杂交 芯片 技术