考点75蛋白质的提取与分离-备战2020年高考生物考点一遍过.doc
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1、考点75 蛋白质的提取与分离高考频度: 难易程度:1蛋白质提取与分离的依据分子的形状、大小;电荷性质和多少;溶解度;吸附性质;对其他分子亲和力。 2凝胶色谱法(1)材料:凝胶多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖、琼脂糖。(2)步骤:混合物上柱洗脱大分子流动快、小分子流动慢收集大分子收集小分子原理:当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3缓冲溶液(1)概念:在一定范围内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀
2、释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。(2)作用:能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响,维持pH基本不变。(3)配制:通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3,NaH2PO4/Na2HPO4等。(4)本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4),目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和科学研究(活性)。4电泳法(1)概念:指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。(2)原理:分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身
3、的大小,形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。(3)类型:琼脂糖凝胶电泳法:由于琼脂糖本身不带电荷,各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同。聚丙烯酰胺凝胶电泳法:在凝胶中加入SDS,使蛋白质解聚成单链,与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物,使其迁移速度完全取决于分子的大小。5实验操作实验操作的基本步骤:样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。(一)样品处理(1)红细胞的洗涤:目的:去除杂蛋白。为防止血液凝固,应先加入柠檬酸钠。所用洗涤液:是五倍体积的生理盐水(质量分数为0.9%的NaCl溶液)。缓慢搅拌,采用低速短时间离心。洗涤干净的标
4、准是上清液没有黄色。(2)血红蛋白的释放:在蒸馏水和甲苯的作用下,红细胞破裂,释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液:(方法)离心。试管中的溶液分为4层,从上往下依次是:无色透明的甲苯层。白色薄层固体:脂溶性物质沉淀层。红色透明液体:血红蛋白溶液层。暗红色沉淀层:红细胞破碎物沉淀。(4)透析:方法:取1 mL血红蛋白溶液装入透析袋,将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7)中,透析12 h。目的:去除样品中分子量较小的杂质。原理:透析袋能使小分子自由进出,而将大分子物质保留在袋内。(二)凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作制作步骤:打孔挖穴安管覆网纱包插
5、管。(2)凝胶色谱柱的装填材料:实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。方法:凝胶用蒸馏水充分溶胀后,配成凝胶悬浮液,一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在。然后用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡12 h,使凝胶装填紧密。(3)样品的加入和洗脱使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内,不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低端时,用试管收集流出液,每5 mL收集一管,连续收集。考向一 蛋白质提取与分离的方法及原理1下列有关提取和分离猪血红蛋白的实验,叙述错误的是A用生理盐水洗涤红细胞,以防止红细胞破裂B用蒸馏水和甲苯处理红细胞,使其释放出血红蛋白C用生理盐水透析血红蛋
6、白溶液,以保持血红蛋白活性D用磷酸缓冲液洗脱,有利于血红蛋白在凝胶柱中移动【参考答案】C【试题解析】A、生理盐水的浓度与红细胞的细胞质的浓度相当,在生理盐水中,红细胞能维持正常的形态,因此用生理盐水洗涤红细胞,可以防止红细胞破裂,A正确;B、红细胞释放血红蛋白,需加入蒸馏水和40%的甲苯,再在磁力搅拌器上充分搅拌10 min,在蒸馏水和甲苯的作用下,红细胞破裂,释放出血红蛋白,B正确;C、将盛有血红蛋白溶液的透析袋放入一定浓度的磷酸缓冲液中透析,C错误;D、磷酸缓冲液可维持血红蛋白的正常特性,用磷酸缓冲液洗脱,有利于血红蛋白在凝胶柱中移动,D正确。2已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质
7、分子,分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示,下列有关蛋白质分离的叙述正确的是A若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min,分子戊在沉淀中,则丙也一定在沉淀中B若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质,则分子甲移动速度最快C将样品装入透析袋中透析12 h,若分子丙保留在袋内,则乙也一定保留在袋内D若用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质,则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远【答案】A【解析】丙的分子量比戊要大,因此若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min,分子戊在沉淀中,则丙也一定在沉淀中,A正确;分析题图可知,甲分子量最小,如果用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质,甲很容易
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