理学生物化学实验技术.ppt
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1、PCR技术及其应用,生物化学实验技术,农业生物学实验教学中心,制作人:张杰道,目 录,PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例,多聚酶链式反应(PCR:Polymerase Chain Reaction),Kary B.Mullis,PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法,此技术获得1993年诺贝尔化学奖。,体内DNA的复制体系,DNA聚合酶(I II III),拓扑异构酶解旋酶类SSB,引物dNTP Mg2+,Mullis的PCR构思,Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60
2、70 80 90 100,100 80 60 40 20,耐热DNA聚合酶,Saiki(1988)将耐热DNA聚合酶引入PCR,使利用热变性解链DNA模板可行。,PCR反应循环,Taq,P1,P2,PCR反应体系,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,Mg2+,模板:DNA引物:P1 P2DNA聚合酶:Taq原料:dNTP反应缓冲液辅助因子:Mg2+,1)PCR反应成分,(1)模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应条件,(2)引物浓度 0.1-0.5 mol
3、/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。(3)Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,(4)dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,(5)Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降;Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等
4、的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2)循环参数变性 使双链DNA解链为单链 94,20-30秒(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,(3)延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定(4)循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多:扩增效率降低 错误掺入率增加,PCR技术的特点,1)高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝(109拷贝),PCR产物每轮循环增加一倍,2)特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反 应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限
5、度地提高扩增效率和 特异性;同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计:(1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 序列。(2)引物长度以15-40 bp为宜。(3)碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。(4)引物内部避免形成二级结构。(5)两引物间避免有互补序列。(6)引物3端为关键碱基;5端无严格限制。,3)操作简便易行,利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出 可用电泳法检出的DNA,可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。,1)不对称PCR 目的:扩增产生特异长度的单链DNA。方法:采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是
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