实验十DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离多角度.ppt
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1、实验十 片段从琼脂糖凝胶中的分离,DNA fragment recovery from the agrose gel,一实验目的及背景,在生物技术实验中,反应获得的目的片段,酶切后所得特定的序列,分子杂交中所制备的探针等,经过琼脂糖凝胶电泳后,目的片段与其它分开,这就需要有一套方法将目的从凝胶中分离出来,通过处理后得到纯化的目的,以用于以后分子杂交,重组子构建,序列分析等.,从凝胶中分离回收的方法,现在常用的技术有:电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法滤膜插片法等其中电洗脱法,经济节省,操作方便,对的回收效果好。,低熔点琼脂糖凝胶法,65oC琼脂糖凝胶熔点低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体,滤膜插片法,
2、High efficientDNA high quality for microinjection5kb fragment100ng DNA fragment10mmol/L EDTA(pH8.0)5 minutes0.5 mol/L NaOH 5 minutes低盐缓冲液50mM/LTris.Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)高盐缓冲液50mM/LTris.Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0),电洗脱法基本原理,将电泳分离后含目的片段的琼脂糖切割下来,装于透析袋中,继续在高电压下电泳,这时目的会从凝胶中电泳出进入透析袋中,由于分子量
3、大,不能透过透析袋,从而保留于透析袋中。取出透析袋中含的溶液,进一步用酚、氯仿抽提纯化。,二实验试剂及仪器,NaHCO3 2%EDTA-Na2 0.01MTBE电泳液10.8g Tris碱0.93g EDTA5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml琼脂糖 透析袋 酚 氯仿 乙醇,三、实验方法,一、透析袋的处理:切取适当长度适析袋。在NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸分钟。弃去煮沸液,加无菌水内外反复洗净透析袋。,二、电洗脱,在长波紫外灯下(nm)将含目标片段的凝胶条带切下装入透析袋中。向透析袋内加入ml电泳缓冲液,使之浸没凝胶,并排空汽泡。将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行
4、),加入适量缓冲液将透析袋浸没(约mm)。接通电源,伏电洗,在紫外灯下观察待全部移出凝胶。改变电场方向继续通电分钟。从透析袋中吸出缓冲液于ml Eppendorf管中。,加入倍体积正丁醇,混匀抽提去。在台式离心机上最高速分钟。吸去上层,正丁醇溶液。重复,二次。自下层言的溶液中加入等体积酚氯仿(个)抽提次。上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc 倍体积预冷无水乙醇,于过夜。,12000g,4下离心分钟,得沉淀。弃上清,加入乙醇洗涤次后弃干乙醇。加入l 溶解。取l 溶液加入2l Loading buffer于琼脂糖上,伏电泳,小时。在紫外透射仪上观察结果。测定溶液OD2
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