分子生物学第五章分子生物学研究方法上生物大分子操作技术ppt课件.ppt
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1、南京农业大学 生命科学学院,分 子 生 物 学,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,2,第五章 分子生物学研究法(上),DNA、RNA及蛋白质操作技术,2022/7/1,2,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,3,第五章 分子生物学研究法(上),2022/7/1,3,南京农业大学 生命科学学院,从20世纪中叶开始,分子生物学研究得到高速发展,主要原因之一是研究方法,特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核
2、心技术。,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,4,第五章 分子生物学研究法(上),2022/7/1,4,南京农业大学 生命科学学院,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分,只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上,这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,5,第五章 分子生物学研究法(上),内容:重
3、组DNA技术回顾DNA基本操作技术RNA基本操作技术基因克隆技术蛋白质组与蛋白质组学技术,2022/7/1,5,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,6,第一节 重组DNA技术回顾,2022/7/1,6,南京农业大学 生命科学学院,三大成就40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达。,2022/7/1,
4、南京农业大学 生命科学学院,7,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,7,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,8,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,8,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,9,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,9,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,10,第一节 重组DNA技术回顾,重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的,它能特异性识别GA
5、ATTC序列,将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。早在1967年,世界上有5家实验室几乎同时报道了DNA连接酶。,2022/7/1,10,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,11,几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,12,DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a. DNA的粘性末端;b. DNA的平末端; c. 化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,13,第一节 重组DNA技术回顾,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶
6、和DNA连接酶进行DNA的切割和重组,还不能满足基因工程的要求,只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上,才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后,还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中,才能保证重组DNA分子的增殖,2022/7/1,13,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,14,第一节 重组DNA技术回顾,重组DNA实验中常见的主要工具酶,2022/7/1,南京农业大学 生命科
7、学学院,15,第二节 DNA操作技术,1. 核酸凝胶电泳技术自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来,按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术,已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。基本原理:生物大分子在一定pH条件下,通常会带电荷。将其放置到电场中,就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度,与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比,与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数,可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。,2022/7/1,南京农业大学 生命科
8、学学院,16,第二节 DNA操作技术,1. 核酸凝胶电泳技术在生理条件下,核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团,呈离子化状态,DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子,把它们放置在电场当中,会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度,取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。,2022/7/1,南京农业大学 生命科学学院,17,第二节 DNA操作技术,1. 核酸凝胶电泳技术琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。
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