分子生物学第六章分子生物学研究方法下基因功能研究技术ppt课件.ppt
《分子生物学第六章分子生物学研究方法下基因功能研究技术ppt课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子生物学第六章分子生物学研究方法下基因功能研究技术ppt课件.ppt(43页珍藏版)》请在启牛文库网上搜索。
1、南京农业大学 生命科学学院,分 子 生 物 学,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,2,第六章 分子生物学研究法(下),基因功能研究技术,2022/7/4,2,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,3,第六章 分子生物学研究法(下),2022/7/4,3,南京农业大学 生命科学学院,从20世纪中叶开始,分子生物学研究得到高速发展,主要原因之一是研究方法,特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技术。,20
2、22/7/4,南京农业大学 生命科学学院,4,第六章 分子生物学研究法(下),内容:基因表达研究技术基因敲除技术蛋白质及RNA相互作用技术基因芯片及数据分析其他分子生物学技术,2022/7/4,4,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,5,第一节 基因表达研究技术,1.基因表达系列分析技术(SAGE)SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达 模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产 物,因此,根据某个序列占总标签数的比例 可分析所对应基因的表达频率。LongSAGE技术。标签来自转录物3端一段21bp的序列,可
3、 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与ShortSAGE方法类似,只是 用了不同的IIS类标签酶(MmeI),并将程 序做了相应修改。,2022/7/4,5,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,6,常规SAGE方法(short SAGE)基本 流程,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,7,第一节 基因表达研究技术,2 RNA的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为:平衡剪切、5选择性剪 切、3选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相 互排斥性剪切。常用RT-PCR
4、法研究某个基 因是否存在选择性剪切。,2022/7/4,7,南京农业大学 生命科学学院,果蝇Dscam基因可 以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,8,选择性剪切的不同类型,RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,9,第一节 基因表达研究技术,3.原位杂交技术原位杂交(ISH)是 用标记的核酸探针,经放射自显影或非放射 检测体系,在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段,分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性(如
5、地高 辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应,若细胞中存在与探针互补 的mRNA分子,两者杂交产生双链RNA,可 通过放射性标记或经酶促免疫显色,对该基 因的表达产物做出定性定量分析。,2022/7/4,9,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,10,mRNA的互补链,杂交信号集中于 纤维细胞中。,负对照,mRNA的 同义链,无杂交 信号,正对照,UBQ10杂交信号遍布于 整个胚珠,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,11,第一节 基因表达研究技术,3.原位杂交技术荧光原位杂交(FISH)首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记,然后用
6、原位杂交法与靶染色体或DNA上特定 的序列结合,再通过与荧光素分子相耦联的 单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的 位置。,2022/7/4,11,南京农业大学 生命科学学院,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,12,第一节 基因表达研究技术,4.基因定点突变技术通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所 编码的氨基酸序列,用于研究某个(些)氨 基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结 合配体能力的影响,也可用于改造DNA调控 元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。目前,主要采用两种PCR方法,重叠延伸技 术和大引物诱变法,在基因序列中进行定点 突变。,2022/7/4,12,
7、南京农业大学 生命科学学院,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,13,寡核苷酸介导的 DNA突变技 术,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,14,重叠延伸介导的定点诱变,大引物诱变法,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院,15,第二节 基因敲除技术,1.基本原理经典遗传学(Forward genetics)是从一 个突变体的表型出发,研究其基因型,进而 找出该基因的编码序列。现代遗传学(Reverse genetics,反向遗传 学)首先从基因序列出发,推测其表现基因敲除(gene knock-out)又称基因打 靶,通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重 组,进
8、行精确的定点修饰和基因改造,具有 专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳 定遗传等特点。型,进而推导出该基因的功能。,2022/7/4,15,南京农业大学 生命科学学院,1.基本原理基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除(又称不完全基因敲除)两种。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时 间和空间的基因敲除。噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母 细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常 用的四种定位重组系统,尤以Cre/Loxp系统 应用最为广泛。,2022/7/4,南京农业大学 生命科学学院
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子生物学 第六 研究 方法 基因 功能 技术 ppt 课件