理学生物起搏种子细胞筛选及gCN通道电药理学实验研究课件.ppt
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1、生物起搏种子细胞筛选及生物起搏种子细胞筛选及HCN通通道电药理学实验研究道电药理学实验研究报告人:杨靖报告人:杨靖导导 师:黄从新师:黄从新 教授教授研究背景研究背景缓缓慢慢性性心心律律失失常常为为临临床床常常见见多多发病发病电电子子起起搏搏器器植植入入术术是是治治疗疗严严重重缓慢性心律失常的首选方案缓慢性心律失常的首选方案电子起搏器存在缺陷电子起搏器存在缺陷非生理性起搏非生理性起搏电池寿命有限电池寿命有限易受外界电磁干易受外界电磁干扰等扰等生物起搏器构建生物起搏器构建-当前研究热点当前研究热点主要内容主要内容生物起搏器种子细胞筛选生物起搏器种子细胞筛选HCN通道电生理及药理学实验研究通道电生
2、理及药理学实验研究第一部分第一部分 生物起搏器种子细胞筛选生物起搏器种子细胞筛选研究对象研究对象心脏干细胞(心脏干细胞(CSCs)脂肪干细胞(脂肪干细胞(ASCs)骨髓间充质干细胞(骨髓间充质干细胞( BMSCs)CSCs的相关研究的相关研究研究内容研究内容CSCs的分离培养及其鉴定的分离培养及其鉴定5-氮杂胞苷诱导氮杂胞苷诱导CSCs向窦房结样细胞向窦房结样细胞分化分化实验方法实验方法小园形、亮的细胞从组织移植块中爬出(箭头所示)(小园形、亮的细胞从组织移植块中爬出(箭头所示)(200200) 流式细胞仪分选流式细胞仪分选左图,分选前流式细胞仪检测培养细胞左图,分选前流式细胞仪检测培养细胞c
3、-kit阳性率阳性率右图,用流式细胞仪分选经右图,用流式细胞仪分选经 c-kit 标记的细胞标记的细胞流式细胞仪检测流式细胞仪检测流式细胞仪鉴定分选后流式细胞仪鉴定分选后CD34、CD45的阳性率的阳性率倒置显微镜观察倒置显微镜观察分选后的单个细胞(左图),培养后簇集式增殖、心球样细胞团形成(右图)分选后的单个细胞(左图),培养后簇集式增殖、心球样细胞团形成(右图)(200)荧光显微镜观察荧光显微镜观察在光学显微镜下在光学显微镜下(左图左图)、荧光显微镜下(右图)观察刚分选、荧光显微镜下(右图)观察刚分选的同一批的同一批c-kit+细胞(细胞(400)增殖能力比较增殖能力比较不同部位间比较不同
4、部位间比较增殖能力比较增殖能力比较不同性别间比较不同性别间比较免疫荧光检测免疫荧光检测分选后分选后4周用抗周用抗cTnI, SMA and CD31抗体检测培养细胞抗体检测培养细胞免疫表型(免疫表型(A,300; B-C,200)A AC CB BRT-PCR检测检测RT-PCR检测检测RT-PCR方法分析分选细胞不同培养时间的方法分析分选细胞不同培养时间的GATA-4, HCN2和和HCN4的的mRNA表达表达 * P 0.05, # P 0.01, 培养培养8周组周组 vs 培养培养4周组周组 免疫荧光检测免疫荧光检测5-Aza诱导诱导CSCs分化分化用抗用抗cTnI, GATA4抗体检测
5、经抗体检测经5-Aza诱导后诱导后CSCs分化的免疫表型分化的免疫表型(A,200; B,400)免疫荧光检测免疫荧光检测用抗用抗HCN4抗体检测经抗体检测经5-Aza诱导后诱导后CSCs分化细胞表达分化细胞表达HCN4蛋白情况蛋白情况(A,400; B,200)荧光检测结果比较荧光检测结果比较不同浓度不同浓度5-aza诱导后的细胞在诱导后的细胞在4周时表达周时表达GATA-4, cTnI和和HCN4蛋白情况蛋白情况 . 10uM组与前两组比较,组与前两组比较, # P 0.055-Aza诱导浓度诱导浓度RT-PCR检测检测RT-PCR技术分析在不同浓度技术分析在不同浓度5-aza诱导后的细胞
6、在不同培养时间的诱导后的细胞在不同培养时间的GATA-4, HCN2和和HCN4 mRNA表达表达RT-PCR检测检测RT-PCR技术分析在不同浓度技术分析在不同浓度5-aza诱导后的培养细胞在不同培养时间的诱导后的培养细胞在不同培养时间的GATA-4, HCN2和和HCN4 mRNA表达表达. P 0.05, # P 0.01, 2组组 vs 3组或组或4组组 结结 论论体体 外外 培培 养养 条条 件件 下下 可可 以以 获获 得得c-kit+ CD34- CD45- CSCs不同部位不同性别来源不同部位不同性别来源CSCs的增殖的增殖 能力存在差异能力存在差异c-kit+CSCs具有向心
7、肌样和窦房结样具有向心肌样和窦房结样 细胞分化的能力细胞分化的能力10M 5-Aza有有增增强强上上述述分分化化的的作作用用ASCs与与BMSCs相关研究相关研究实验流程实验流程ASCsBMSCs细胞形态学流式细胞仪检测细胞表面标记物增殖能力比较5-AZa诱导cTnIcTnI阳性率比较阳性率比较HCN4 mRNAHCN4 mRNA相相对含量检测对含量检测倒置显微镜观察、拍照CD29、CD44CD73、CD14CD34转染HCN4基因CCK-8试剂盒转染效率凋亡率形态学比较形态学比较 (P5)( 200)( 200)( 200)( 200)ASCsASCsASCsASCsBMSCsBMSCsBM
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