优质实用课件推选聚合酶链式反应PCR原理与相关技术.ppt
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1、聚合酶链式反应(聚合酶链式反应(PCR)原理与相关技术原理与相关技术一、一、PCR技术技术二、定量二、定量PCR技术技术三、数字三、数字PCR技术技术一、一、PCR原理原理PolymeraseChainReaction(PCR):在:在体外特异性地扩增某个基因。体外特异性地扩增某个基因。1、历史、历史1971年,Khorana提出体外人工复制DNA的设想。1985年Cetus公司科学家K.B.Mullis使设想变成现实,采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断(37),并获1993年诺贝尔化学奖。1988年R.K. Saiki 应用Taq DNA聚合酶(水生栖热菌)于PCR反应;同年,Cetu
2、s公司发明自动热循环仪。K.B.Mullis2、原理、原理预变性变性退火延伸变性退火延伸保存循环(循环(30次)次)95预变性1 min95变性 1 min目的:DNA双链成单链56退火目的:引物先与模板匹配72延伸1-2 min 目的:聚合酶在引物3端加核苷酸,合成新链12保存循循环环特异性强、灵敏度高、快速、简便特异性强、灵敏度高、快速、简便循环次数循环次数DNA数量数量1224382010485763010737418241、Taq酶酶:具有53聚合酶和外切酶活性,无35外切酶活性,不能修复错误的碱基配对,因此必须测序。需激活剂:Mg2+ 2、pfuDNA聚合酶聚合酶:有53和35外切酶
3、活性,出错率最低,但PCR产物平端。3、TaqPlusDNA聚合酶聚合酶:是Taq和pfu的混合物,Taq PCR产物3端带A。4、引物引物:互补;引物长度;3碱基序列必须与模板配对;尽量提高GC含量;避免连续相同碱基排列或开成回纹结构;避免形成引物二聚体。5、Tm=(G+C)4+(A+C) 26、primer5.07、模板纯度模板纯度:不一定要纯,但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量(100ng/100l)8、dNTP浓度浓度2.5 mM each特殊说明:特殊说明:普通PCRRT-PCRTAIL-PCR Real-time PCR数字PCRPCR类型:类型:普通PC
4、R仪梯度PCR仪原位PCR仪定量PCR仪数字PCR仪二、实时荧光定量二、实时荧光定量PCR(Real-timequantificationPCR)1、历史、历史实时荧光定量实时荧光定量PCR技术于技术于1996年由美国年由美国AppliedBiosystems公公司推出,该技术不仅实现了司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常从定性到定量的飞跃,而且与常规规PCR相比,它的特异性更强、更能有效解决相比,它的特异性更强、更能有效解决PCR污染问题、自动污染问题、自动化程度更高等特点。化程度更高等特点。原理原理:在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料(如SYBR GREEN 1
5、)或特异性的荧光探针(如Taqman探针),利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程,再通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。也就是通过荧光的变化,获得不同样品达到一定荧光信号(阈值)所需要的循环次数Ct(Cycle Threshold)。Ct值的含义:值的含义:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。1、荧光探针和荧光染料:、荧光探针和荧光染料:分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物,前者特异性高,后者操作简单。SYBRGREEN1:结合双链DNA小沟后,荧光强度增强,但也会结合引物二聚体或单链引起的二级结构。变性时,双链分开,荧光消失。特别说明:特别说
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