优质PPT课件推选琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法.ppt
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1、实验三实验三琼脂糖凝胶电泳技术的琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法原理和方法一一 实验目的实验目的n学习琼脂糖凝胶电泳分离学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法的原理和方法n检测碱裂解法提取质粒的结果检测碱裂解法提取质粒的结果n检测双酶切法鉴定重组质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果(后续实验)(后续实验)n检测检测PCR法鉴定质粒的结果法鉴定质粒的结果(后续实验)(后续实验)二二 实验原理实验原理(1 1)某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率,电泳的速率与)某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率,电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。核酸分子大小和构型有关。 DNA DNA分子在碱
2、性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快,紧密构型快于松散型开环分子或线性分子,从分子质量越小跑得越快,紧密构型快于松散型开环分子或线性分子,从而可以分离大小不同的而可以分离大小不同的DNADNA或或RNARNA分子。分子。(2 2)琼脂糖是一种)琼脂糖是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于孔径的大小决定于琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度。浓度越高,孔隙越小,其分辨能力浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线
3、型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.35 560600.60.61 120200.70.70.80.810100.90.90.50.57 71.21.20.90.96 61.51.50.20.23 312.012.00.10.12 2 配制多大浓度的琼脂糖凝胶,要根据被检的配制多大浓度的琼脂糖凝胶,要根据被检的DNADNA分子大小来确定。分子大小来确定。琼琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。(3 3)溴化乙锭为扁平状分子,在紫外光照射下发射荧光。)溴化乙锭为扁平状分
4、子,在紫外光照射下发射荧光。EBEB可与可与DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA复合物,其荧光强度与复合物,其荧光强度与DNADNA的含量成正比。据此可判断的含量成正比。据此可判断DNADNA分子量大小分子量大小和粗略估计样品和粗略估计样品DNADNA浓度浓度。 表表1 1 琼脂糖凝胶的浓度与琼脂糖凝胶的浓度与DNADNA分子大小的关系分子大小的关系三 仪器、材料与试剂1. 1.质粒样品、酶切样品和质粒样品、酶切样品和PCRPCR样品。样品。 2. 2.凝胶电泳系统和电泳图像分析系统凝胶电泳系统和电泳图像分析系统( (凝胶成像系统凝胶成像系统) )等。等。 3. 3.琼脂糖、琼
5、脂糖、 1XT 1XTAE电泳缓冲液、电泳缓冲液、GoldviewGoldview、 6X 6X载样缓冲载样缓冲液液 ( 6X loading buffer 6X loading buffer)和)和DNADNA分子量标准(分子量标准(Marker Marker )等。等。1.1.凝胶电泳系统凝胶电泳系统DYY-6CDYY-6C型型 双稳定时电泳仪电源(北双稳定时电泳仪电源(北京六一)京六一) 输出范围(显示分辨率):6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W美国美国Bio-radBio-rad伯乐伯乐 小型水平电泳槽小型水平电泳槽Mini-Sub Mini-Sub Cell GT
6、 Cell Cell GT Cell 2.2.凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统3.Marker3.Marker一一个个已已知知分分子子质质量量的的DNADNA样样品品做做最最对对照照,用用来来确确定定待待测样品的相对分子质量。测样品的相对分子质量。4.4.常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液缓冲液缓冲液缓冲容量缓冲容量迁移速度迁移速度分辨率分辨率用途用途TAETAE最低最低最快最快( (高高1010) )高分子量高高分子量高高度复杂高度复杂DNADNA混混合物;超螺旋合物;超螺旋DNADNATBETBE很高很高较慢较慢低分子量高低分子量高价格昂贵,不常价格昂贵,不常用用TPETPE 电泳指示剂溴酚兰在
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