分子克隆工具酶及其应用.ppt
《分子克隆工具酶及其应用.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子克隆工具酶及其应用.ppt(74页珍藏版)》请在启牛文库网上搜索。
1、分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用l限制性内切酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 lDNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化 l核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 l核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 l核酸连接酶核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 l核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 l其其它它酶酶类类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶一一.限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现1.细菌限制修饰系统的发现细菌限制修饰系统的发现We
2、rnerArber于于1962-1968年发现,年发现,1968年分离到年分离到I型限制酶。型限制酶。2.限制酶限制酶HindII的发现的发现HOSmith和和Wilox于于1970年首次从流感嗜血年首次从流感嗜血杆菌(杆菌(H. influenzae)中发现并分离到中发现并分离到HindII限制酶。限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans(1971年)用年)用HindII绘制绘制SV40的限制的限制酶谱。酶谱。二二.限制修饰系统的种类限制修饰系统的种类1.I型型:由三个基因构成,由三个基因构成,hsdR;hsdM;hsdS(hostspecifi
3、cityforDNArestrictionmodificationandspecificity)位于染色体上,三位于染色体上,三个基因构成一个复合体,限制酶需要个基因构成一个复合体,限制酶需要ATP、Mg2+、SAM(腺苷甲硫氨酸)。腺苷甲硫氨酸)。2.II型型:限制与修饰基因产物独立起作用,在限制与修饰基因产物独立起作用,在. coli中这两种基因位于质粒上。中这两种基因位于质粒上。3.III型型:修饰酶与型酶相同,修饰酶与型酶相同,hsd与与hsd基基因产物结合成一亚单位,限制酶是独立存在的。因产物结合成一亚单位,限制酶是独立存在的。上述三个系统中,只有上述三个系统中,只有II型限制酶与甲
4、基化酶具型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性,因而被广泛用于有相当高的核苷酸识别特异性,因而被广泛用于基因工程中。基因工程中。三三.限制性内切酶的定义、命名限制性内切酶的定义、命名1.定义定义:广义指上述三个系统中的限制酶;广义指上述三个系统中的限制酶;狭义指狭义指II型限制酶。型限制酶。2.命名命名:限制酶由三部分构成,即菌种名、限制酶由三部分构成,即菌种名、菌系编号、分离顺序。菌系编号、分离顺序。例如:例如:Hind前三个字母来自于菌种名前三个字母来自于菌种名称称H. influenzae,“”表示菌系为型血表示菌系为型血清型;清型;“”“”表示分离到的第三个限制酶。表示分离到的
5、第三个限制酶。EcoRIEscherichia coliRIHindHaemophilusinfluensae dSacI(II)Streptomycesachromagenes I()四四限制酶的特点限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点)识别)识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸MboINGATCN;AvaIIGG(A/T)CC BamHIGGATCC:PpuMIPuGG(A/T)CCPy NotIGCGGCCGC; SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG FokI5-()9-33-()13-5外侧,产生外侧,产生-端突端突起起)富含)富含)对称性)对称
6、性双双对称对称EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5)切点大多数在识别顺序之内,也有例外切点大多数在识别顺序之内,也有例外)限制酶切后产生两个末端,末端结构是)限制酶切后产生两个末端,末端结构是-和和-2.末端种类末端种类)-端突起端突起,个数为或个核苷酸,个数为或个核苷酸Pst I5-CTGCAG-35-CTGCAG-33-GACGTC-53-GACGTC-5)-端突起端突起,个数为或个核苷酸,个数为或个核苷酸EcoRI5-GAATTC-35-GOHPAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAPHOG-5)平齐末端平齐末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-
7、GGGCCC-53-GGGCCC-5)非互补的粘性末端非互补的粘性末端)切点在识别顺序之外的,如:)切点在识别顺序之外的,如:FokI FokI5-GGATG()9-35-GGATG(N)93-CCTAC()13-53-CCTAC(N)13)能识别简并顺序的,如:)能识别简并顺序的,如:AvaIAvaI5-CPyCGPuG-3CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG)相容性末端相容性末端如:如:BamHIGGATCC BglIIAGATCT MboI,Sau3AINGATCN上上述述几几种种限限制制酶酶产产生生的的DNA片片段段仍仍可可相相连连,由由此此形形成成的的重重组组分分子
8、子能能被被MboI和和Sau3AI识识别别和和酶酶切切,但但BamHI和和BglII的的识识别别机机率率只有只有1/16。 BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/ABamHI和和BglII(AGATCT)两两种种酶酶产产生生的的相相容容性性末末端端,相相连连后后不不能为两种酶所识别和酶切。能为两种酶所识别和酶切。 BamHI+BglIIA/GGATCT/C 不同末端的连接特性不同末端的连接特性:除第除第4 4种末端不能进行不同种末端不能进行不同DNA分分子或同种子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外,其余分子不同切点产生的末端相连外,其余4 4种种末端可以相互连接。末端可以
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子 克隆 工具 及其 应用