1、分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用l限制性内切酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 lDNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化 l核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 l核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 l核酸连接酶核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 l核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 l其其它它酶酶类类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶一一.限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现1.细菌限制修饰系统的发现细菌限制修饰系统的发现We
2、rnerArber于于1962-1968年发现，年发现，1968年分离到年分离到I型限制酶。型限制酶。2.限制酶限制酶HindII的发现的发现HOSmith和和Wilox于于1970年首次从流感嗜血年首次从流感嗜血杆菌（杆菌（H. influenzae）中发现并分离到中发现并分离到HindII限制酶。限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans（1971年）用年）用HindII绘制绘制SV40的限制的限制酶谱。酶谱。二二.限制修饰系统的种类限制修饰系统的种类1.I型型：由三个基因构成，由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecifi
3、cityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。腺苷甲硫氨酸）。2.II型型：限制与修饰基因产物独立起作用，在限制与修饰基因产物独立起作用，在. coli中这两种基因位于质粒上。中这两种基因位于质粒上。3.III型型：修饰酶与型酶相同，修饰酶与型酶相同，hsd与与hsd基基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有上述三个系统中，只有II型限制酶与甲
4、基化酶具型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。基因工程中。三三.限制性内切酶的定义、命名限制性内切酶的定义、命名1.定义定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指狭义指II型限制酶。型限制酶。2.命名命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。菌系编号、分离顺序。例如：例如：Hind前三个字母来自于菌种名前三个字母来自于菌种名称称H. influenzae，“”表示菌系为型血表示菌系为型血清型；清型；“”“”表示分离到的第三个限制酶。表示分离到的
5、第三个限制酶。EcoRIEscherichia coliRIHindHaemophilusinfluensae dSacI(II)Streptomycesachromagenes I()四四限制酶的特点限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点）识别）识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CC BamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPy NotIGCGGCCGC； SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG FokI5-()9-33-()13-5外侧，产生外侧，产生-端突端突起起）富含）富含）对称性）对称
6、性双双对称对称EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和-2.末端种类末端种类）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸Pst I5-CTGCAG-35-CTGCAG-33-GACGTC-53-GACGTC-5）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸EcoRI5-GAATTC-35-GOHPAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAPHOG-5）平齐末端平齐末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-
7、GGGCCC-53-GGGCCC-5）非互补的粘性末端非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：）切点在识别顺序之外的，如：FokI FokI5-GGATG()9-35-GGATG(N)93-CCTAC()13-53-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5-CPyCGPuG-3CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG）相容性末端相容性末端如：如：BamHIGGATCC BglIIAGATCT MboI,Sau3AINGATCN上上述述几几种种限限制制酶酶产产生生的的DNA片片段段仍仍可可相相连连，由由此此形形成成的的重重组组分分子
8、子能能被被MboI和和Sau3AI识识别别和和酶酶切切，但但BamHI和和BglII的的识识别别机机率率只有只有1/16。 BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/ABamHI和和BglII(AGATCT)两两种种酶酶产产生生的的相相容容性性末末端端，相相连连后后不不能为两种酶所识别和酶切。能为两种酶所识别和酶切。 BamHI+BglIIA/GGATCT/C 不同末端的连接特性不同末端的连接特性:除第除第4 4种末端不能进行不同种末端不能进行不同DNA分分子或同种子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余分子不同切点产生的末端相连外，其余4 4种种末端可以相互连接。末端可以
9、相互连接。五五.异源同序酶异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制种限制酶酶2.特点：特点：1）识别相同顺序）识别相同顺序2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG六六.限制酶的星反应（限制酶的星反应（staractivity）七七.1.特点特点:限制酶识别序列特异性降低限制酶识别序列特异性降低2.发生星反应的限制酶和条件发生星反应的限制酶和条件（见下页）（见下页）3.星反应的利用和避免星反应的利用和避免表表1
10、1 具有星反应的限制性内切酶与条件具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件限制酶诱发星活性的条件a a识别序列识别序列AvaAvaI I 1, 2, 41, 2, 4BamBamHI HI 1 - 5, 8 G GATCN, G1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCC PuATCCBstBstI I 2, 42, 4BsuBsuI I 2, 4, 62, 4, 6EcoEcoRI RI 1, 2, 4 - 6 N AATTN1, 2, 4 - 6 N AATTNHaeHae 2, 4 2, 4HhaHhaI I 2, 4, 72, 4, 7HinHind 6d 6Hpa
11、HpaI I 1, 2, 41, 2, 4PstPstI I 1, 2, 4, 71, 2, 4, 7PvuPvu 2, 4 2, 4SalSalI I 1, 2, 4, 71, 2, 4, 7ScaScaI I 4 - 6, 84 - 6, 8 SstSst 2, 4 2, 4XbaXbaI I 2, 4, 72, 4, 7a.1a.1：亚乙二醇亚乙二醇(45%)(45%)；2:2:甘油甘油(12%)(12%)；3 3：乙醇：乙醇(12%)(12%)；4 4：高酶：高酶/ /DNADNA比比(25(25U/g)U/g)；5：Mn+代替代替Mg+；6:pH8.5;7:二甲基亚砜二甲基亚砜(8%
12、);8:无无NaCl。七七.其它特异性的内切酶及其用途其它特异性的内切酶及其用途1.末端酶（末端酶（terminase）：）：5-GGGCGGCGACCTN-3N-5，出现的频率约出现的频率约412分子量为分子量为117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）2.Omega核酸酶（核酸酶（I-SceI）：）：由内含子编码，用于由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约的剪切，出现的频率约418=6.9X1010bp，其其识别顺序为识别顺序为5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3TATT3.I-PpoI：来自于来自于Physarum polycephalum识别序列：识
13、别序列：CTCTCTTAAGGTAGCAATT4.用途用途遗传标记，遗传标记，构建载体构建载体八八.限制酶的用途限制酶的用途1.DNA重组重组2.限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（突变分析（RFLP分析）分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切限制酶的部分酶切与完全酶切附：附：IIS型限制酶的特点型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。具有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，点的一侧，1-20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反
14、应。酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。个核苷酸。5.均为单体，分子量为均为单体，分子量为47108kD。第二节第二节DNA甲甲 基基 化化 酶酶一一.甲基化酶的种类与识别顺序甲基化酶的种类与识别顺序1.限制修饰系统限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：甲基腺嘌呤：在在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型
15、，它与相应的限制型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同不同MHpaICmCGGHpaICCGG相同相同2.Ecoli的的dam、dcm甲基化酶甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。饰系统。damGmATC，dcmCmCA/TGG3.哺乳动物的甲基化酶哺乳动物的甲基化酶该酶可使该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等
16、过程有关。复制、基因转录等过程有关。4.Ecoli中依赖于甲基化的限制修饰系统中依赖于甲基化的限制修饰系统mrr（mA/A）、）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）二二.甲基化酶活性对限制酶活性的影响甲基化酶活性对限制酶活性的影响1.dcm和和dam甲基化酶对限制酶的影响甲基化酶对限制酶的影响1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠是完全重叠还是边界重叠如：完全重叠如：完全重叠BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG)边界重叠边界重叠ClaI-dam；Sau96I-dcm2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠叠如：如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI；dcm-BstNI表表2 2 对甲基化敏感的限制性内切酶对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶限制酶 识别序列识别序列* * 甲基化酶甲基化酶AvaAva GG(A/T)GG(A/T)CCCC(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmBclBcl
