优质实用课件推选植物遗传转化方法和技术.ppt
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1、第四章第四章 植物基因工程植物基因工程 植物基因工程是近植物基因工程是近2020年来随着年来随着DNADNA重组技术、重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。来的现代生物技术。 通过植物基因工程获得转基因植物,在农业通过植物基因工程获得转基因植物,在农业生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的意义。目前,已获得很多有重大经济价值的转基意义。目前,已获得很多有重大经济价值的转基因植物。因植物。基因工程的基本步骤目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子
2、外源基因的表达和产物的分离重组子的检测本节主要内容根癌农杆菌介导法基因枪介导法其它转化方法第一节第一节 植物遗传转化方法植物遗传转化方法常用的植物转基因方法:常用的植物转基因方法:l到目前为止到目前为止, , 已确立了已确立了1111种植物转基因方法。根据其种植物转基因方法。根据其转化原理,可分为三大类,即转化原理,可分为三大类,即利用载体的转化系统利用载体的转化系统,不用任何载体,采用物理、化学方法直接将外源基因不用任何载体,采用物理、化学方法直接将外源基因导入受体细胞的导入受体细胞的直接转化系统直接转化系统以及利用植物生殖细胞以及利用植物生殖细胞等种质媒介的等种质媒介的种质转化系统种质转化
3、系统。l现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和受现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和受体细胞等归纳如图体细胞等归纳如图4-14-1。一、根癌农杆菌介导法l根癌农杆菌介导法的分子机制l农杆菌介导法需要具备的条件l农杆菌介导法的基本流程1 1、植物冠瘿瘤、植物冠瘿瘤植物的一种癌症植物的一种癌症(1)冠瘿瘤的起因:)冠瘿瘤的起因: 由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。(2)冠瘿瘤的侵染过程:)冠瘿瘤的侵染过程: 细菌通过伤口进入植物,在基因水平细菌通过伤口进入植物,在基因水平上转化植物。细菌上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植中的编码基因在植物细胞中表达,
4、刺激植物细胞不受控制的物细胞中表达,刺激植物细胞不受控制的分裂,形成瘤。分裂,形成瘤。(一)根癌农杆菌介导法的分子机制(一)根癌农杆菌介导法的分子机制2 2、TiTi质粒质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质,为共根瘤农杆菌染色体外的遗传物质,为共价闭合环状的价闭合环状的DNADNA分子。分子。为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力;为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力;参与寄主细胞合成激素的能力;参与寄主细胞合成激素的能力;诱发植物产生冠瘿瘤;诱发植物产生冠瘿瘤;赋予寄主分解冠瘿碱的能力;赋予寄主分解冠瘿碱的能力;决定寄主范围。决定寄主范围。 (1 1)TiTi质粒的功能质粒的功能(2 2)TiTi质
5、粒的功能区域质粒的功能区域 T-DNA区区 Vir 区区 Con 区区 Ori 区区200 kb T-DNA区(区(transferred-DNA regions):): 核心区核心区左边界左边界右边界右边界 T-DNA T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时,从是农杆菌侵染植物细胞时,从TiTi质粒上质粒上切割下来转移到植物细胞的一段切割下来转移到植物细胞的一段DNADNA,故称之为转,故称之为转移移DNADNA。 该该DNADNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。片段上的基因与肿瘤的形成有关。lVirVir区是一段长度为区是一段长度为35KB35KB操纵子;操纵子;l包含六个基因:包含六个基因:Vi
6、rAVirA、VirBVirB、VirCVirC、VirDVirD、VirEVirE、VirGVirG。l该区段上的基因能激活该区段上的基因能激活T-DNAT-DNA转移,使农杆菌表现出毒性,转移,使农杆菌表现出毒性,故称之为毒性区。故称之为毒性区。lT-DNAT-DNA区与区与VirVir区在质粒区在质粒DNADNA上彼此相邻,上彼此相邻, 合起来约占合起来约占TiTi质粒质粒DNADNA的三分之一的三分之一。 Vir区操纵子基因的结构与功能区操纵子基因的结构与功能LBRBT-DNAVir Con区(区(regions encoding conjugations) 该区段上存在着与细菌接合转
7、移的有关基因(该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因(tra),),调控调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因,基因,诱导诱导Ti质粒转移,因此称之为质粒转移,因此称之为接合转移编码区接合转移编码区。 Ori区(区(origin of replication) 该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制,故称之为质粒的自我复制,故称之为复制复制起始区起始区。定向转移到寄主植物细胞内定向转移到寄主植物细胞内T-DNAT-DNA链整合植物基因组链整合植物基因组受伤植物产生酚类物质,诱导受伤植物产生酚类物质,诱导VirVir基因的表达基因的表达
8、编码编码 核酸内切酶核酸内切酶依次在依次在RBRB、LBLB序列中产生缺口序列中产生缺口单链单链T-DNAT-DNA被释放被释放3、T-DNA转移的机制转移的机制植物细胞酶体系合成双链合成双链T-DNAT-DNA链分子链分子VirE2蛋白的核定位作用4、植物遗传转化的载体系统、植物遗传转化的载体系统一元载体(顺势载体)一元载体(顺势载体)双元载体(反式载体)双元载体(反式载体) Ti Ti质粒分子量过大,一般在质粒分子量过大,一般在160160240kb240kb; 分布各种限制酶的多个切点;分布各种限制酶的多个切点; T-DNA T-DNA区内含有许多编码基因,干扰宿主植物中内源激区内含有许
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