临床PCR试剂盒选用和质检.ppt
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1、临床临床PCRPCR试剂盒的选用和质检试剂盒的选用和质检卫生部临床检验中心 李金明PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR试剂盒的组成试剂盒的组成n核酸提取试剂n核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂n产物检测试剂(有些使用全自动分析仪的PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成,故无专门的产物检测试剂)影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素试剂盒质量的因素n内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素:试剂盒质量的因素: 扩增所需的原材料扩增所需的原材料n寡核苷酸引物和探针n缓冲液和dNTPn聚合酶、逆转录酶等PCRPCR反应混合物反应混合物 Mg2+Mn2+dCTPdG
2、TPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase 生 物 素 标 记 的 引 物 和和 或或 和和寡核苷酸引物和探针寡核苷酸引物和探针n其对试剂盒质量的影响首先是纯度。其对试剂盒质量的影响首先是纯度。纯度的判断可根据260/280吸光度比值来判断,如2.0,则需重新纯化。另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳,如出现一条以上的带或迁移位置错误,则需重新纯化。n是否有污染。是否有污染。n结合特异性(浓度)结合特异性(浓度)dNTPdNTP和缓冲液和缓冲液ndNTP(包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP)的浓度n缓冲液:在储存和扩增
3、循环中稳定、作为聚合酶活性所必须的Mg(或用于rTth的Mn)的浓度以及pH等逆转录酶、逆转录酶、DNADNA聚合酶聚合酶n酶的浓度n酶的活性核酸扩增方法核酸扩增方法nPCRnRTPCRn转录依赖的扩增(TMA)n连接酶链反应(LCR)n链替代扩增(SDA)等影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素:试剂盒质量的因素: 核酸提取核酸提取n核酸提取的有效性n核酸提取的简便性 影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素:试剂盒质量的因素: 产物检测产物检测n杂交固相n特异探针及其标记物影响影响PCRPCR试剂盒质量的因素试剂盒质量的因素n内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计n外在因素:试剂盒的运输和
4、贮存外在因素:试剂盒的运输和贮存试剂盒的运输和贮存试剂盒的运输和贮存nPCR试剂盒的有效期一般为6个月,这是指在适当的贮存温度下。核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20下;产物检测部分试剂则贮存于28。n试剂盒从厂家到用户手中,均要经历运输及运输中的贮存,任一环节的不当,均会影响试剂盒的临床使用质量。PCRPCR试剂盒的分类试剂盒的分类n定性测定:PCR-ELISA、PCR-膜上杂交(杂交梳)、荧光PCR(分子信标和Taq Man等)n定量测定: PCR-ELISA 、Taq Man和Amplisensor荧光定量、 Amplicor PCR-ELISA定量等。PCRPCR试剂盒的选用原则试剂盒
5、的选用原则n参考试剂生产厂家的信息广告n参考同行对有关试剂盒的使用效果n参考有关机构的综合评价n根据使用目的n根据所在实验室的技术特点n根据所在医院患者的承受能力PCRPCR试剂盒的质检试剂盒的质检n外包装:厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等。n内包装:试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损以、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。PCRPCR试剂盒的质检试剂盒的质检( (定性测定定性测定) )n性能质检性能质检n采用血清(样本)盘(采用血清(样本)盘(PanelPanel)质检质检: PCR试剂血清(样本)盘由一定数量的原血清阴、阳性样本、23份纯化核酸(DNA或RNA或cDNA)样本以及
6、35份系列稀释阳性样本所组成。样本总数可定在20份左右。 n原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率;纯化核酸样检出的特异性、灵敏度和符合率;纯化核酸样本用于判断本用于判断DNADNA扩增或逆转录及扩增或逆转录及DNADNA扩增的有效扩增的有效性;系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下性;系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限。限。试剂特异性、灵敏度和符合率试剂特异性、灵敏度和符合率计计 算算 公公 式式试剂特异性、灵敏度和符合率试剂特异性、灵敏度和符合率计计 算算 公公 式式n灵敏度() (a / a+c)100%n特异性()
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