实验七质粒DNA提取及鉴定1Power课件多角度.ppt
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1、 实验十质粒实验十质粒DNADNA的快速提取及检测的快速提取及检测相关知识及原理质粒质粒(Plasmid) (Plasmid) :独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的一种环状双链一种环状双链DNADNA分子分子, ,大小可为大小可为1kb1kb到到200kb200kb。存在。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。细菌细胞中最多。年由年由LederburgLederburg正式命名为质粒。正式命名为质粒。质粒有三种构型:、共价闭合环状质粒有三种构型:、共价闭合环状DNADNA(ccc
2、DNAcccDNA);、);、开环开环DNADNA(ocDNAocDNA);、线状);、线状DNADNA。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶电泳时,出现不同这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶电泳时,出现不同的迁移速率,走的最快的是超螺旋构型,其次是线状构型,的迁移速率,走的最快的是超螺旋构型,其次是线状构型,最慢的是开环构型。最慢的是开环构型。质粒按复制方式分为两种类型:质粒按复制方式分为两种类型:1 1、松弛型质粒:复制不需要质粒编码的功能蛋白,、松弛型质粒:复制不需要质粒编码的功能蛋白,高拷贝数,独立于细菌细胞而自主复制;高拷贝数,独立于细菌细胞而自主复制;、严紧型质粒:复制需要一个质粒编
3、码的蛋白,、严紧型质粒:复制需要一个质粒编码的蛋白,低拷贝数,随细菌染色体的复制而同步进行。低拷贝数,随细菌染色体的复制而同步进行。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种基因运载工具在中扩增或表达的重要媒介物,这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。大多数基因工基因工程中具有极广泛的应用价值。大多数基因工程使用松弛型质粒。程使用松弛型质粒。本实验原理:本实验原理:DNA DNA 是具有一定结构的物质,一些特殊的环境是具有一定结构的物质,一些特殊的环境会导致会导致DNADNA的的变性,如加热、极端变性,如加热、极端
4、pHpH值、有机溶剂、值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等,而适宜的环境又可以使尿素、酰胺试剂等,而适宜的环境又可以使DNADNA复性。复性。SDS(SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子表面活性十二烷基硫酸钠)是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性,所以性,所以SDSSDS处理细菌细胞后,会导致细菌细胞壁的处理细菌细胞后,会导致细菌细胞壁的破裂,从而使质粒破裂,从而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞中同时从细胞中同时释放出来。释放出来的释放出来。释放出来的DNADNA遇到强碱性(遇到强碱性(NaOHNaOH
5、)环境,环境,就会变性。然后,用酸性乙酸钾来中和溶液,使溶就会变性。然后,用酸性乙酸钾来中和溶液,使溶液处于中性,质粒液处于中性,质粒DNADNA将迅速复性,而染色体将迅速复性,而染色体DNADNA,由于分子巨大,难以复性。离心后,质粒由于分子巨大,难以复性。离心后,质粒DNADNA将在上将在上清中,而染色体清中,而染色体DNADNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒的底部。通过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取从细菌中提取出来。出来。杂质:杂质: 蛋白质、基因组蛋白质、基因组DNADNA、RNARNA、糖、糖1.1.培培养养细细菌菌
6、:将将带带有有质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌接接种种到到液液体体培培养养基基( (含含抗抗生生素素) ),3737培培养养12121616小小时时; ;(共共5 5个个样样品品,CS, S1, S2, S3和和5) )2.2.取取液液体体培培养养液液1ml1ml于于1.5ml 1.5ml EppendorfEppendorf管管中中,10000r/min10000r/min离离心心1min1min,去去掉掉上上清清液液; ;再再加加入入1 1ml于于离离心心管管中中,10000r/min离心离心1min,去掉上清。,去掉上清。3.3.加加入入100100 l l质质粒粒提提取取液液1 1 ,充充
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