1、第六章 种子检验原理和技术,第五节 真实性和品种纯度鉴定,一、有关定义和目的意义(一)有关定义 1.种子真实性：种子真实性(cultivar genuineness或trueness)是指一批种子所属品种、种或属与文件(品种证书、标签等)是否相同，是否名符其实。这是鉴定种子样品的真假问题。2.品种纯度：品种纯度(varietal purity)是品种在特征、特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检样品种子数的百分率表示。这是鉴定品种一致性程度高低的问题。3.变异株:变异株(off-type)是一个或多个性状与原品种育成者所描述性状明显不同的植株。,(二)目的意义(1)保证种子质量，充分发
2、挥品种的增产作用。(2)促进优质优价政策的贯彻，提高效益。,二、真实性和品种纯度鉴定原理,品种具备新颖性、特异性、一致性及稳定性。品种区分的外在表现就是品种的特征特性，其内在基础是遗传信息DNA的差异。DNA可转录形成RNA序列，再翻译形成氨基酸系列进而形成多肽蛋白质。蛋白质是构成植物细胞的基本成分之一，也可作为酶成分。酶能催化各级代谢反应，初级、次级反应，进而形成各种有机化合物，如碳水化合物、有机酸、脂肪等物质，这些化学成分在植物能量贮存和细胞结构方面有巨大作用，并反映在其解剖结构和形态特征方面。因此，我们可以借助各种有效手段，对遗传信息本身及其调节产物与表现在不同层次水平上进行区分鉴定，找
3、出品种之间所具有的形态学、细胞遗传学、解剖学、物理学、生理学、化学和生物化学等方面的差异，才能鉴定成功。,三、监控途径和方法(一)监控途径,田间检验室内检验田间小区鉴定种子认证体系,(二)鉴定方法 室内检验 田间小区鉴定 各种方法在准确性、经济性、可操作性等方面均有不同程度差异，可根据实际检验目的和要求选择合适的技术和方法。总的原则：简单、易行、经济、准确、快速。,四、种子纯度的形态学鉴定,(一)种子形态特征鉴定,1.鉴定品种的依据 根据种子形态特征方面的差异。2.鉴定方法 随机从送验样品中数取400粒种子，鉴定时须设重复，每个重复不超过100粒种子。必须备有标准样品或鉴定图片和有关资料。根据
4、种子的形态特征，必要时可借助放大镜等进行逐粒观察，区分出本品种和异品种种子，计数，并按下列公式计算品种纯度百分率。查对容许差距 良种品种纯度是否达到国家标准种子质量标准、合同和标签的要求，可利用表7.2进行判别。,Barley seed showing different surfaces,(二)幼苗形态鉴定,通过两个途经：一种途径是在温室或培养箱中，提供给植株以加速发育的条件(类似于田间小区鉴定，只是所需时间较短)，当幼苗达到适宜评价的发育阶段时，对全部或部分幼苗进行鉴定；另一种途径是让植株生长在特殊的逆境条件下，测定不同品种对逆境的不同反应来鉴别不同品种，如培养在不同营养成分，不同光周期，
5、不同有毒成分等环境。1.种植方法 所有样品均应播种在惰性砂床中，加水湿润到适宜湿度后播种。,2.浇水方法 出苗前，全部种植盘或盆在出苗前应加水一致，以满足出苗所需水分。出苗后，为鉴定色素而种植的大豆、莴苣幼苗，应用Hoagland No.l营养液浇水，每4天一次；当鉴定芽鞘和茎上色素而种植的小麦、燕麦幼苗，应用缺磷的Hoagland No.1营养液，每4天浇1次。其余几天可以用水浇。3.光温控制 通常利用高强度的光照如白冷光荧光灯和白炽灯光源，光照强度33000Lux（勒克司）；一般采用24h连续光照，但除草剂敏感性测定和光周期反应测定例外。温度一般控制在25条件下，但也有例外。,4.幼苗形态
6、特征鉴定 小麦幼苗的芽鞘和茎色鉴定，可在播后大约7天进行，颜色从绿到紫。可用1%NaCl或HCL溶液湿润滤纸或用紫外光照射幼苗12h，使颜色加深。高梁和玉米幼苗芽鞘和顶端颜色鉴定可在出苗后14天进行。芽鞘颜色分紫红色和绿色，顶端颜色可能有4种类型，深紫色(在茎和叶近轴和远轴表面全深紫色)；中等紫色(紫色茎，近轴叶表面几乎深紫色，远轴叶表面黄棕色)；浅紫色(幼苗在茎和叶边缘有局部紫色，主要为绿色)和绿色(幼苗含绿色)。燕麦幼苗可在播后1014天进行鉴定，芽鞘和叶鞘颜色分绿色和紫红色，叶鞘茸毛有无(光滑、茸毛、混合型)等。,大豆幼苗颜色可在1014天进行，分4种，绿色，赤褐色(下胚轴下部有)，淡紫
7、色(下胚轴紫色，上胚轴绿色)和深紫色(上、下胚轴均为紫色)。播后21天(3片小叶完全展开)进行茸毛颜色和上面一片小叶背面茸毛着生角度（直立、平贴，中间）及小叶形状（卵形（长宽比小于1.6），披针形（长宽比大于2.0）鉴定。,五、种子纯度的快速鉴定,(一)化学鉴定,主要根据不同品种皮壳成分和化学物质的差异，而对不同化学试剂反应显色的差异来鉴定品种。1.苯酚染色法 又名石炭酸，其染色的原理是单酚、双酚、多酚在酚酶的作用下氧化成为黑色素(C77H98O55N14S)，由于每个品种皮壳内酚酶活性不同，将苯酚氧化呈现深浅不同的褐色。该法主要适用于小麦、水稻和燕麦、大麦、黑麦草、早熟禾等牧草种子。,2.愈
8、创木酚(C7H802)法 其原理是大豆种皮内具有过氧化物酶，能使过氧化氢分解而放出氧，使愈创木酚氧化而产生红棕色的4-邻甲氧基醌，由于不同品种过氧化物酶的活性不同，使溶液颜色也有深浅之分。3.碱液(NaOH或KOH)处理 可用于十字花科种子真实性鉴定。4.草木樨硫酸四氨铜鉴定 5.高粱种子氢氧化钾一漂白粉测定法 6.燕麦种子氯化氢测定法 7.小麦种子的氢氧化钠测定法 8.羽扇豆属植物碱测定法,苯酚染色法,Fig.Phenol test:Uniform ivory color reaction in a genetically pure wheat variety(A),and a mixtur
9、e of color reaction in a sample containing more than one variety(B).,A B,小麦种子的氢氧化钠测定法,Fig.Sodium hydroxide(NaOH)test:(left)Red wheat,and(right)white wheat.,(二)物理鉴定,荧光分析法，其原理是根据不同品种种子和幼苗含有荧光物质的差异，利用紫外线照射物体后有激发光的现象，将不可见的短光波转变为可见的长光波。由于光的持久性不同可分成两种类型：一种叫荧光现象，紫外光连续照射后物体能发光，当停止照射时，被激发的光也随之停止。另一种叫磷光现象，当紫外
10、光停止照射后，激发生成的光在或长或短时期内可继续发光。这里主要应用荧光法鉴定品种，因为不同品种和类型的种子，其种皮结构和化学成分不同，在紫外光照射下发出荧光也不同。鉴定的方法有两种：1.种子鉴定法 2.幼苗鉴定法,六、种子纯度的电泳鉴定,（一）应用电泳鉴定品种的理论基础,1.电泳基础 电泳是指带电颗粒在电场作用下向与其电性相反方向的电极移动的现象。由于蛋白质是由许多氨基酸组成，除肽链的两端有自由的氨基和羧基外，在侧链上还有很多可解离的基团，如氨基、羧基、酚基、巯基、咪唑基、胍基等，在一定条件下，这些基团都能解离成为带电基团。在不同的pH条件下，可分别解离成正负离子，因而带不同的电荷。,一般地，
11、氨基酸在酸性溶液中带正电荷，在碱性深液中带负电荷。在某一pH时蛋白质所带的正负电荷相等，在电场中既不向正极移动，也不向负极移动，这时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点。当溶液的pH值小于pI时，蛋白质带正电荷，反之带负电荷。由于蛋白质带有电荷，因此在电场中能泳动，泳动速度主要取决于所带电荷的数量、分子的大小及形状和电场特征。,H pI pH pI pH pI正电荷 负电荷,(1)电泳基本设备,温控设备(冰箱、保温箱)和电泳设备(电泳仪和电泳槽)。,(2)电泳缓冲系统,指由处理或溶解样品、配制或浸泡支持物及电泳时电极槽所用缓冲液构成的缓冲体系。缓冲系统在电泳过程中有两个主要作用：一是缓冲电泳过程中
12、支持物上和电泳槽内pH的改变。电泳过程中阳极一端形成酸性离子，阴性一端形成碱性离子，溶液pH的改变程度与电泳持续时间、所用的电压和产生的电流呈正相关。二是缓冲液形成正负极与支持介质之间的离子通道，起传导电流的作用。,1)缓冲系统的类型 解离缓冲系统 非解离缓冲系统 2)缓冲液的离子强度 3)缓冲液的PH 3)支持介质的选择 4)电场特征,2.应用电泳鉴定品种的理论基础,在品种鉴定中，个体或群体间蛋白质成分的差异，反映基因表达的根本差异。由于基因是与遗传特征相联系的，所以蛋白质标志能用以标记这些特征。这种特征体系是一套基因，或是部分染色体，或是整条染色体，或是完整的基因组。通过分析足够多的蛋白质
13、标志，可以涉及大量的基因组。由于作物品种是由各种不同遗传表现的种质集合体所组成，所以对这些集合体中的特种蛋白质或酶的成分进行比较就能用来表示或描述这些材料的特征。电泳方法提供了一种进行这种比较的绝好方法。这种有效的方法是基于各品种蛋白质的多态性，即以多种不同的分子形式存在。,(二)种子蛋白质和同工酶的种类及常用电泳方法,1.蛋白质的分类和电泳方法 根据TBOsborne的分类，种子蛋白质可按不同溶解特性分为4种类型。(1)清蛋白：通常可用同工酶电泳方法进行鉴定。(2)球蛋白：目前，我国应用最多的玉米种子盐溶蛋白电泳鉴定就是对球蛋白进行品种鉴定。(3)醇溶蛋白：目前国际上和ISTA广泛应用的小麦
14、和大麦种子醇溶蛋白电泳，就是利用这种蛋白进行品种电泳鉴定。(4)谷蛋白：,2.同工酶的结构的性质：(1)同工酶的结构 酶蛋白是很多氨基酸按一定顺序排列而形成的一条多肽链。在同一生物有机物体的同一器官，甚至同一细胞里，某些酶虽然具有相同的催化活性，但是它们之间分子的氨基酸顺序却有相当大的差异。因此，在酶学上把这种催化活性相同而分子结构不同的酶称为同工酶。,(2)同工酶分类 Markert(1978)把同工酶的分为两类。a.单基因决定同工酶，但其氨基酸序列上存在着差异。如水稻幼苗芽鞘颜色控制的酯酶同工酶。b.后成同工酶，这种酶在翻译后再经修饰而产生同工酶。Whitt(1967年)也把同工酶按其结构
15、分为两类：a.单体同工酶，这是指一条多肽链组成的酶。b.多体同工酶，这是指由多条多肽链组成的酶。在多体同工酶中，按其初级结构的同异，又可分为同质多体同工酶(同聚体:由相同肽链组成)和异质多体同工酶(异聚体)。,3.目前鉴定品种的常用电泳方法：(1)1996国际种子检验规程已将鉴定小麦和大麦品种醇溶蛋白PAGE标准参照程序，鉴定豌豆属和黑麦草属的SDSPAGE标准参照方法、超薄层等电聚焦电泳测定杂交玉米和种子纯度的标准参照方法列入规程。(2)国际植物新品种保护联盟的植物新品种DUS检测指南所列入的电泳鉴定方法：1994年制订有关分析小麦高分子量麦谷蛋白的SDS-PAGE方法、分析大麦醇溶蛋白SD
16、S-PAGE方法、分析大麦B-和C-醇溶蛋白的A-PAGE方法、分析玉米同工酶的淀粉凝胶电泳方法。,(3)我国农作物种子检验规程所列入的品种鉴定方法和国内常用电泳方法：我国GBT3543l-7-1995农作物种子检验规程已将ISTA规程的鉴定小麦和大麦品种的PAGE标准参照方法、GBT2930l-11-2001牧草种子检验规程已将ISTA规程的鉴定豌豆和黑麦草品种的PAGE标准参照方法列入应用。目前我国各地常用和研究较为有效的品种鉴定的电泳方法有：玉米种子盐溶蛋白PAGE(NYT4492001)，棉花种子的水溶性蛋白质AUS-PAGE,西瓜种子的SDS-PAGE，水稻和蔬菜幼苗的等电聚焦电泳，水稻的同工酶电泳鉴定等方法。,(三)电泳图谱的分类和鉴别 1.电泳谱带的分类：(1)根据谱带特征、血缘关系和鉴别方便可将电泳谱带分为如下两类：a.公共带(共同带)指同种同属的不同品种，由于其起源进化的历史和生态条件相同，具有数目不等的相同的谱带。b.特征谱带(指示谱带或标记谱带)指不同品种之间所存在的稳定的可明确鉴别、可靠区分的遗传的谱带，如互补型谱带和杂种型谱带等，如经过若干次电泳，并在不同实验
