1、第六章微生物的生长与环境因子,Microbial Growth,生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。,第一部分：微生物的生长,个体生长与群体生长,个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体
2、生长的状况）个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长=个体生长+个体繁殖通常把一个细胞分裂成两个细胞所需要的时间，称为代时。,一些细菌的代时,菌名培养基培养温度 代时E.coli（大肠杆菌）肉汤 3717minE.coli 牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶 371618E.aerogenes 组合 372944B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶376687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）
3、牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖2534446Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）组合271200,第一节 微生物纯培养分离及生长测定方法,一、获得纯培养的方法,纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.,（1）液体稀释法（2）平板划线分离法（Streak Plate）（3）平板涂布分离法
4、（Spread Plate）（4）选择性培养分离法（5）单细胞（单孢子）分离法,首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.,（1）液体稀释法,（2）平板划线分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）,An inoculating loop is used to thin out organisms on the surf
5、ace of the agar.,（3）平板涂布分离法（Spread Plate）,简单易行，但易造成机械损伤,Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.,（4）选择性培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离富集培养,（5）单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行
6、。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,二、微生物生长量的测定方法,（一）微生物细胞数目的检测法1。总菌数的测定（计数器直接计数，染色涂片计数，比浊法）2。活菌数的测定（平板计数法、液体稀释法、膜过滤法）,（二）微生物生长量的测定,1。直接法(干重法，体积法)2。间接法（比浊法，碳、氮含量法，DNA测定法等）,1.血球计数板法,原理：将1mm20.02mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80小格，计数其中的
7、细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,2.涂片染色法,应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数涂布面积/视野面积10稀释倍数,3.平板菌落计数法,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格
8、无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,A standard plate count(viable count)reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony;plate counts are reported as number of colony-form
9、ing units(CFU)per ml(CFU/ml)or per g(CFU/g)of sample.,4。薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,5.干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。该法适合菌浓度较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到
10、2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,6.比浊法,原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。,7.生理指标法,测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、
11、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,第二节 微生物的生长曲线,一、微生物培养：研究群体生长规律，首先应对微生物进行培养。培养的方法有：分批培养和连续培养 这两种方法既可用于纯种培养，也可用于混合,1 分批培养（batch culture）：,分批培养（batch culture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。(P116),2 连续培养（continuous culture）,连续培养（continuous culture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时
12、间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。类型：恒浊连续培养和恒化连续培养(P119),原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,（1）连续培养原理,恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持
13、营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究及污水生物处理。,恒化器Chemostat 或bactogen,概念：调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,恒浊连续培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇
14、等。,恒浊器与恒化器的比较,二、细菌的纯培养生长曲线,将少量细菌接种到一种新鲜的、定量的液体培养基中进行分批培养，定时取样计数，以细菌个数或细菌数的对数为纵坐标，以培养时间为横坐标，连接坐标纸上各点成一条曲线即细菌的生长曲线。生长曲线可以细分为六个阶段、四个时期：延迟期（停滞期）、加速期、对数生长期、减速期、稳定期（静止期）、衰亡期（或死亡期）。(P116),典型的生长曲线（Growth curve）,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同,加速期,减速期,其它名称：迟滞期、调整期、适应期1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横
15、轴。2.特点：P117生长速率=0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,.停滞期（lag phase）,菌种：繁殖速度较快(世代时间短)的菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；营养：培养基成分 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种
16、后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素：P116-117,认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：,在工业上需设法尽量缩短延迟期；P117采取的缩短lag phase 的措施有：增加接种量；（群体优势-适应性增强）采用对数生长期的健壮菌种；调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。选用繁殖快的菌种,.对数期（logarithmic phase）,其他名称：指数期 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。特点：生长速率最大，即代时最短菌体大小、形态、生理特征等比较一致代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感影响因素：菌种代谢产物营养物浓度氧气,延长措施：定时定量加入营养物质，同时排出代谢产物，或使用连续培养。应用意义：由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,.静止期（stationary phase）,又称：稳定期或最高
